Neutralización del virus SARS-CoV-2 (linaje B.1.1) por suero hiperinmune de llama (Lama glama) en cultivo de células Vero / Neutralization of SARS-CoV-2 (lineage B.1.1) by hyperimmune llama (Lama glama) serum in Vero cell culture

Objetivo. Evaluar la respuesta serológica de anticuerpos de una llama (Lama glama) a la inmunización del virus SARS-CoV-2 (linaje B.1.1) y la capacidad neutralizante del suero de llama hiperinmune frente al virus SARS-CoV-2 (linaje B.1.1) en células Vero. Materiales y métodos. Se inmunizó una llama con el virus SARS-CoV-2 inactivado (Linaje B.1.1) y se analizaron muestras de suero para evaluar el nivel de anticuerpos mediante ELISA, así como la reactividad a antígenos de SARS-CoV-2 mediante Western Blot. Además, se evaluó la neutralización viral en cultivos celulares por la Prueba de Neutralización por Reducción de Placas (PRNT, por sus siglas en inglés). Resultados. Se observó un aumento en la serorreactividad en la llama inmunizada desde la semana 4 en adelante. Los títulos de anticuerpos fueron más elevados en el séptimo refuerzo de inmunización. Los resultados de Western Blot confirmaron los hallazgos positivos del ELISA, y los anticuerpos del suero inmune reconocieron varias proteínas virales. El ensayo de neutralización (PRNT) mostró una neutralización viral visible, concordante con los resultados de ELISA y Western Blot. Conclusiones. Los hallazgos sugieren que el suero hiperinmune de llama podría constituir una fuente de anticuerpos terapéuticos contra las infecciones por el virus SARS-CoV-2 (linaje B.1.1) y que deberá ser evaluado en estudios posteriores.

Objective. To evaluate the serological antibody response of a llama (Lama glama) to SARS-CoV-2 (B.1.1 lineage) immunization and the neutralizing capacity of hyperimmune llama serum against SARS-CoV-2 virus (B.1.1 lineage) in Vero cells. Materials and methods. A llama was immunized with inactivated SARS-CoV-2 (B.1.1 lineage). Serum samples were analyzed to evaluate the level of antibodies by ELISA, as well as reactivity to SARS-CoV-2 antigens by Western Blot. In addition, viral neutralization in cell cultures was assessed by the Plate Reduction Neutralization Test (PRNT). Results . Seroreactivity increased in the immunized llama from week 4 onwards. Antibody titers were the highest after the seventh immunization booster. Western blot results confirmed the positive ELISA findings, and immune serum antibodies recognized several viral proteins. The neutralization assay (PRNT) showed visible viral neutralization, which was in accordance with the ELISA and Western Blot results. Conclusions. The findings suggest that hyperimmune llama serum could constitute a source of therapeutic antibodies against SARS-CoV-2 infections (lineage B.1.1), and should be studied in further research.

Clonamiento, expresión y seroreactividad de la proteína recombinante de ensamblaje de lipopolisacáridos - D (LptD) de Bartonella bacilliformis / Cloning, expression and seroreactivity of the recombinant lipopolysaccharide assembly protein - D (LptD) from Bartonella bacilliformis

RESUMEN Objetivo. Evaluar in silico y a nivel serológico el potencial antigénico del dominio extracelular recombinante de la proteína de ensamblaje de lipopolisacáridos - D (LptD) de Bartonella bacilliformis (dexr_LptD). Materiales y métodos. Mediante el análisis in silico se realizó la selección de una proteína de B. bacilliformis con potencial antigénico e inmunogénico. El gen de la proteína seleccionada se clonó en Escherichia coli TOP10 y se expresó en Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS. La proteína recombinante fue expresada usando isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) y se optimizaron las condiciones de inducción. Por último, se purificó con resina Ni-IDA (His60 Ni Superflow) y se realizó un ensayo de Western Blot. Resultados. In silico, la proteína seleccionada fue LptD por estar localizada en la membrana externa y ser antigénica e inmunogénica. Las condiciones optimizadas para la inducción del dexr_LptD fueron 0,5 mM IPTG, 16 h, medio TB (Terrific Broth), etanol al 3% (v/v), 28 ºC, OD600: 1-1,5 y 200 r.p.m. La purificación se realizó en condiciones denaturantes a pequeña escala y se obtuvo 2,6 µg/mL de dexr_LptD parcialmente purificada. El ensayo de Western Blot mostró una reacción positiva entre los sueros provenientes de pacientes con la enfermedad de Carrión y dexr_LptD, ello evidencia la antigenicidad del dexr_LptD. Conclusiones. El dexr_LptD muestra antigenicidad in silico y a nivel serológico, estos resultados son base para posteriores estudios sobre candidatos vacunales contra la enfermedad de Carrión.

ABSTRACT Objective. To evaluate in silico and at the serological level the antigenic potential of the recombinant extracellular domain of the lipopolysaccharide assembly protein - D (LptD) of Bartonella bacilliformis (dexr_LptD). Materials and Methods. Through in silico analysis, we selected a B. bacilliformis protein with antigenic and immunogenic potential. The selected protein gene was cloned into Escherichia coli TOP10 and expressed in Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS. Recombinant protein was expressed using isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) and induction conditions were optimized. Finally, it was purified with Ni-IDA resin (His60 Ni Superflow) and a Western Blot assay was conducted. Results. In silico, the selected protein was LptD because it is located in the outer membrane and is antigenic and immunogenic. Optimized conditions for dexr_LptD induction were 0.5 mM IPTG, 16 hours, TB (Terrific Broth) medium, 3% (v/v) ethanol, 28 ºC, OD600: 1-1.5 and 200 rpm. Purification was carried out under denaturating conditions on a small scale and we obtained 2.6 μg/mL of partially purified dexr_LptD. The Western Blot assay showed a positive reaction between the sera from patients with Carrión's Disease and dexr_LptD, which shows the antigenicity of dexr_LptD. Conclusions. The dexr_LptD shows antigenicity both in silico and at the serological level, these results are the basis for further studies on vaccine candidates against Carrion's Disease.

Technical-economic analysis of a Peruvian RNA vaccine production plant against COVID-19 / Análisis técnico - económico de una planta de producción peruana de vacunas ARN contra el COVID-19.

Objective: To carry out a technical-economic analysis of a plant for the production of RNA vaccines against COVID-19 to cover the local Peruvian demand. Materials and methods: With the use of a specialized software in bioprocesses and local resource costs, it was possible to simulate a whole bioprocess: i) Primary manufacturing (RNA synthesis, purification using tangential filtration, size exclusion chromatography and lipid encapsulation (RNA-LNP), which allowed to produce up to 0.019Kg of RNA-LNP/batch; and ii) Secondary Manufacturing (dispensing and filling of vials). In this way, fixed investment costs (CaPex), operating costs per batch (OpEx) and packaging costs (CE) were calculated. Results: Based on the simulated model, to cover the total demand (32.6 million Peruvian citizens → 100 million doses → ~ 3Kg of synthetic RNA) will require 160 batches produced in a period of 10 months in a single facility. The total investment estimated for the plant is US$791.2 million: CaPex [US $ 91.5 million (68.8% correspond to validation actions and start-up activities)]; OpEx per lot [US $ 4.14 million (97.7% associated with input costs)] which would amount to US$ 662.7 million (160 lots) and one CE: US $ 37 million. The estimated cost per dose was calculated at US$ 7.91. Conclusions: The simulation of bioprocesses gives us an approximation of the technical-economic component to establish investment opportunities in a plant that produces RNA vaccines in Peru, serving as an input for other plants that produce biologics that meet the demands of national public health.

Objetivo: Realizar un análisis técnico-económico de una planta de producción de vacunas ARN contra el COVID-19 para cubrir la demanda local peruana. Materiales y métodos: Con el uso de un software especializado en bioprocesos y costeos de recursos locales se logró simular un proceso de producción compuesto: i) Manufactura primaria (Síntesis de ARN, purificación empleando filtración tangencial, cromatografía de exclusión por tamaño y encapsulamiento lipídico (ARN-LNP); lo cual permitió producir hasta 0.019Kg de ARN­LNP/lote; y ii) Manufactura Segundaria (dispensación y llenado de viales). De esta forma se calcularon costos de inversión fijo (CaPex), costos operativos por lote (OpEx) y costos de envasado (CE). Resultados: En base al modelo simulado, para cubrir la demanda total (32.6 millones de ciudadanos → 100 millones de dosis → ~3Kg de ARN sintético) se requerirán de 160 lotes producidos en un periodo de 10 meses en una sola facilidad. La inversión total estimada para la planta es de US$791.2 millones: CaPex [US$91.5 millones (68.8% corresponden a acciones de validación e inicio de actividades)]; un OpEx por lote [US$4.14 millones (97.7% asociados a gastos de insumos)] lo que ascenderían un monto de US$662.7 millones (160 lotes) y un CE: US$37 millones. El costo estimado por dosis fue calculado en US$7.91. Conclusiones: La simulación de bioprocesos nos brinda una aproximación del componente técnico-económico para establecer oportunidades de inversión en una planta productora de vacunas de ARN en el Perú, sirviendo como insumo para otras plantas productoras de biológicos que cubran las demandas de salud pública nacional.

Neutralization of the lethal activity from Bothrops atrox venom by hyperimune llama serum (Lama glama). / Neutralización de la actividad letal del veneno de serpiente Bothrops atrox por suero hiperinmune de llama (Lama glama).

OBJECTIVES: To evaluate the capacity of the hyperimmune llama serum (Lama glama) to neutralize the lethal activity of Bothrops atrox venom in laboratory mice. MATERIALS AND METHODS: Mean lethal dose (LD50) was calculated from a Bothrops atrox venom sample pool from Peru. The antibody titers were measured by ELISA assay; and the immune serum neutralization potency was measured by calculating the mean effective dose (ED50) during the immunization period. RESULTS: The venom's LD50 was 3.96 µg/g; similar to what was found in other studies about Bothrops atrox carried out in Peru. The titers of antibodies against the venom increased rapidly in the llama, demonstrating a fast immune response; however, the neutralization capacity increased slowly and required several doses and immunization reinforcements, obtaining a ED50 of 3.30 µL/g mouse and a neutralization potency of 3.6 mg/mL after 15 immunizations. CONCLUSIONS: The hyperimmune llama serum is able to neutralize the lethality of the Bothrops atrox venom from Peru in laboratory mice.

OBJETIVOS: Evaluar la capacidad del suero hiperinmune de llama (Lama glama) para neutralizar la letalidad del veneno de la serpiente Bothrops atrox en ratones de laboratorio. MATERIALES Y MÉTODOS: Se calculó la dosis letal media (DL50) de un pool de venenos de serpientes de Bothrops atrox de Perú, y se midieron los títulos de anticuerpos por ensayo ELISA; así como la potencia de neutralización del suero inmune por el cálculo de la dosis efectiva media (DE50) durante el periodo de inmunización. RESULTADOS: La DL50 del veneno fue de 3,96 µg/g, similar a otros trabajos realizados en Bothrops atrox en Perú. Los títulos de anticuerpos contra el veneno se incrementan rápidamente en la llama mostrando una rápida respuesta inmune; sin embargo, la capacidad de neutralización se incrementa más lentamente y requiere de varias dosis y refuerzos de las inmunizaciones alcanzado una DE50 de 3,30 µL/g ratón y una potencia de neutralización 3,6 mg/mL después de 15 inmunizaciones. CONCLUSIONES: El suero hiperinmune de llama es capaz de neutralizar la letalidad del veneno de la serpiente Bothrops atrox de Perú en ratones de laboratorio.

Neutralización de la actividad letal del veneno de serpiente Bothrops atrox por suero hiperinmune de llama (Lama glama) / Neutralization of the lethal activity from Bothrops atrox venom by hyperimune llama serum (Lama glama)

RESUMEN Objetivos: Evaluar la capacidad del suero hiperinmune de llama (Lama glama) para neutralizar la letalidad del veneno de la serpiente Bothrops atrox en ratones de laboratorio. Materiales y métodos: Se calculó la dosis letal media (DL50) de un pool de venenos de serpientes de Bothrops atrox de Perú, y se midieron los títulos de anticuerpos por ensayo ELISA; así como la potencia de neutralización del suero inmune por el cálculo de la dosis efectiva media (DE50) durante el periodo de inmunización. Resultados: La DL50 del veneno fue de 3,96 µg/g, similar a otros trabajos realizados en Bothrops atrox en Perú. Los títulos de anticuerpos contra el veneno se incrementan rápidamente en la llama mostrando una rápida respuesta inmune; sin embargo, la capacidad de neutralización se incrementa más lentamente y requiere de varias dosis y refuerzos de las inmunizaciones alcanzado una DE50 de 3,30 µL/g ratón y una potencia de neutralización 3,6 mg/mL después de 15 inmunizaciones. Conclusiones: El suero hiperinmune de llama es capaz de neutralizar la letalidad del veneno de la serpiente Bothrops atrox de Perú en ratones de laboratorio.

ABSTRACT Objectives: To evaluate the capacity of the hyperimmune llama serum (Lama glama) to neutralize the lethal activity of Bothrops atrox venom in laboratory mice. Materials and methods: Mean lethal dose (LD50) was calculated from a Bothrops atrox venom sample pool from Peru. The antibody titers were measured by ELISA assay; and the immune serum neutralization potency was measured by calculating the mean effective dose (ED50) during the immunization period. Results: The venom's LD50 was 3.96 μg/g; similar to what was found in other studies about Bothrops atrox carried out in Peru. The titers of antibodies against the venom increased rapidly in the llama, demonstrating a fast immune response; however, the neutralization capacity increased slowly and required several doses and immunization reinforcements, obtaining a ED50 of 3.30 μL/g mouse and a neutralization potency of 3.6 mg/mL after 15 immunizations. Conclusions: The hyperimmune llama serum is able to neutralize the lethality of the Bothrops atrox venom from Peru in laboratory mice.

Development of Nanobodies Against Hemorrhagic and Myotoxic Components of Bothrops atrox Snake Venom.

Snake envenoming is a globally neglected public health problem. Antivenoms produced using animal hyperimmune plasma remain the standard therapy for snakebites. Although effective against systemic effects, conventional antivenoms have limited efficacy against local tissue damage. In addition, potential hypersensitivity reactions, high costs for animal maintenance, and difficulties in obtaining batch-to-batch homogeneity are some of the factors that have motivated the search for innovative and improved therapeutic products against such envenoming. In this study, we have developed a set of nanobodies (recombinant single-domain antigen-binding fragments from camelid heavy chain-only antibodies) against Bothrops atrox snake venom hemorrhagic and myotoxic components. An immune library was constructed after immunizing a Lama glama with whole venom of B. atrox, from which nanobodies were selected by phage display using partially purified hemorrhagic and myotoxic proteins. Biopanning selections retrieved 18 and eight different nanobodies against the hemorrhagic and the myotoxic proteins, respectively. In vivo assays in mice showed that five nanobodies inhibited the hemorrhagic activity of the proteins; three neutralized the hemorrhagic activity of whole B. atrox venom, while four nanobodies inhibited the myotoxic protein. A mixture of the anti-hemorrhagic and anti-myotoxic nanobodies neutralized the local tissue hemorrhage and myonecrosis induced by the whole venom, although the nanobody mixture failed to prevent the venom lethality. Nevertheless, our results demonstrate the efficacy and usefulness of these nanobodies to neutralize important pathologies of the venom, highlighting their potential as innovative therapeutic agents against envenoming by B. atrox, a viperid species causing many casualties in South America.

Near-Complete Genome Sequence of a 2019 Novel Coronavirus (SARS-CoV-2) Strain Causing a COVID-19 Case in Peru.

A near-complete genome sequence was obtained for a novel coronavirus (SARS-CoV-2) strain obtained from an oropharyngeal swab from a Peruvian patient with coronavirus syndrome (COVID-19) who had contact with an individual who had returned to Peru from travel to Italy.

[Identification of carbapenem-resistant genes in enterobacteria from peruvian hospitals, 2013-2017]. / Identificación de genes de resistencia a carbapenémicos en enterobacterias de hospitales de Perú, 2013-2017.

The global spread of carbapenemases is a significant public health concern. The aim of this report is to describe the presence of KPC-type carbapenem-resistant genes and enterobacteria isolated in 12 hospitals and forwarded to the Peruvian National Institute of Health's National Infection Reference Laboratory during the period between 2013 and 2017. The strains were identified by conventional methods; antimicrobial resistance was determined by phenotypic and biochemical methods. The presence of resistant genes was detected by conventional PCR. Eighty-three (83) strains harboring carbapenemases were identified: 26 (31.3%) carrying the blaKPC gene, 56 (67.5%) the blaNDM gene, and one strain (1.2%) with the blaIMP gene. This is the first report that shows the circulating carbapenemases genes in Hospitals in Peru of cases submitted for their confirmation to the National Reference Laboratory, so it is necessary to improve the surveillance to better understand their situation in our country.

La diseminación global de carbapenemasas es de importancia en la salud pública. El objetivo del estudio es describir la presencia de genes de resistencia a carbapenémicos tipo KPC y metalobetalactamasas en enterobacterias aisladas de 12 hospitales y remitidos al Laboratorio de Referencia Nacional de Infecciones Intrahospitalarias del Instituto Nacional de Salud de Perú durante los años 2013 al 2017. Las cepas fueron identificadas por métodos convencionales, la resistencia antimicrobiana fue determinada por métodos fenotípicos, bioquímicos y la presencia de genes de resistencia, se detectaron por PCR convencional. Se identificaron 83 cepas con carbapenemasas: 26 (31,3 %) portando el gen blaKPC, 56 (67,5 %) el gen blaNDM y una (1,2 %) cepa con el gen blaIMP. Es el primer reporte que da a conocer los genes de carbapenemasas circulantes en hospitales de Perú, por lo que se requiere mejorar la vigilancia para tener un mejor conocimiento de la situación en Perú.

Identificación de genes de resistencia a carbapenémicos en enterobacterias de hospitales de Perú, 2013-2017 / Identification of carbapenem-resistant genes in enterobacteria from peruvian hospitals, 2013-2017

RESUMEN La diseminación global de carbapenemasas es de importancia en la salud pública. El objetivo del estudio es describir la presencia de genes de resistencia a carbapenémicos tipo KPC y metalobetalactamasas en enterobacterias aisladas de 12 hospitales y remitidos al Laboratorio de Referencia Nacional de Infecciones Intrahospitalarias del Instituto Nacional de Salud de Perú durante los años 2013 al 2017. Las cepas fueron identificadas por métodos convencionales, la resistencia antimicrobiana fue determinada por métodos fenotípicos, bioquímicos y la presencia de genes de resistencia, se detectaron por PCR convencional. Se identificaron 83 cepas con carbapenemasas: 26 (31,3 %) portando el gen blaKPC, 56 (67,5 %) el gen blaNDM y una (1,2 %) cepa con el gen blaIMP. Es el primer reporte que da a conocer los genes de carbapenemasas circulantes en hospitales de Perú, por lo que se requiere mejorar la vigilancia para tener un mejor conocimiento de la situación en Perú.

ABSTRACT The global spread of carbapenemases is a significant public health concern. The aim of this report is to describe the presence of KPC-type carbapenem-resistant genes and enterobacteria isolated in 12 hospitals and forwarded to the Peruvian National Institute of Health's National Infection Reference Laboratory during the period between 2013 and 2017. The strains were identified by conventional methods; antimicrobial resistance was determined by phenotypic and biochemical methods. The presence of resistant genes was detected by conventional PCR. Eighty-three (83) strains harboring carbapenemases were identified: 26 (31.3%) carrying the blaKPC gene, 56 (67.5%) the blaNDM gene, and one strain (1.2%) with the blaIMP gene. This is the first report that shows the circulating carbapenemases genes in Hospitals in Peru of cases submitted for their confirmation to the National Reference Laboratory, so it is necessary to improve the surveillance to better understand their situation in our country.